三國鼎立局面形成的關鍵戰役是赤壁之戰。
曹操基本統一北方後，作玄武池訓練水兵，並對可能動亂的關中地區採取措施，隨即於建安十三年七月出兵十多萬南征荊州(約今湖北、湖南)，欲一統南北。時孫權已自江東統軍攻克夏口(今武漢境)，打開了西入荊州的門戶,正相機吞併荊、益州(治成都),再向北發展;而依附荊州牧劉表的劉備，「三顧茅廬」得諸葛亮為謀士參謀，以其隆中對策，制定先占荊、益，聯合孫權，進圖中原的策略，並在樊城大練水陸軍。
曹操採用侍中、尚書令荀?之計，領大軍直出葉縣、宛城(今河南南陽),另遣輕騎襲襄陽(今屬湖北)。八月，劉表病亡，曹軍放慢進軍速度，施加軍威，欲不戰而得荊州。時孫權派魯肅以弔喪為名,往觀形勢,拉攏劉備，團結劉表舊將，對付曹操。魯肅在途中得知曹操進軍荊州的消息，乃晝夜兼程趕向襄陽。劉表次子劉琮繼任荊州牧,遣使投降曹操,迎接曹軍。正加緊準備迎敵的劉備得知劉琮投降時，曹軍已過宛城。
九月，曹操至新野(今屬河南)接受劉琮投降後，逼向荊州腹地。劉備為避曹軍銳氣，與諸葛亮、徐庶等率十餘萬軍民倉促南撤，退向戰略要地江陵(今屬湖北荊沙)，並令關羽領萬餘水兵順漢水、溯江水會師。劉備至當陽長阪(今當陽境)，與魯肅相見，接受其勸說,願率軍轉東,向孫權靠近。時曹操已過襄陽，恐劉備先占江陵，親率精騎5000，晝夜行300多里，追上劉備，將其擊敗，並獲徐庶之母，迫徐庶來歸。張飛率20騎斷後,拆長阪橋,勒馬橫矛，令曹軍疑懼，劉備方得脫險,東奔漢津(今鍾祥境),恰遇關羽船隊，劉表長子、江夏太守劉琦也領萬餘人接應。劉備軍順漢水至夏口，先遣諸葛亮至柴桑(今江西九江西南)見孫權，共謀抗曹，自率軍屯樊口(今湖北鄂州境)。
孫權見劉備新敗，又懾於號稱80萬的曹軍聲威，對聯劉舉棋不定。諸葛亮與魯肅、周瑜等精闢分析形勢,指出曹軍不過20餘萬,且有後方不安、遠道勞師、水土不服、短於水戰等弱點，堅定了孫權抗曹決心。孫權不顧主降派張昭等反對,命周瑜、程普為左右督,魯肅為贊軍校尉，率3萬精銳水兵，與劉備合軍共約5萬，溯江水而上，進駐夏口。
曹操乘勝取江陵後，又以劉表大將文聘為江夏太守，仍統本部兵，鎮守漢川(今江漢平原)。益州牧劉璋也遣兵給曹操補軍，開始向朝廷交納貢賦。曹操更加驕傲輕敵，不聽謀臣賈詡暫緩東下的勸告，送信恐嚇孫權，聲稱要決戰吳地。冬，親統軍順長江水陸並進。
孫劉聯軍在夏口部署後，溯江迎擊曹軍，遇於赤壁。曹軍步騎面對大江，失去威勢，新改編及荊州新附水兵，戰鬥力差，又逢疾疫流行，以致初戰失利，慌忙退向北岸，屯兵烏林(今湖北洪湖境)，與聯軍隔江對峙。
曹操下令將戰船相連，減弱了風浪顛簸，利於北方籍兵士上船，欲加緊演練，待機攻戰。周瑜鑒於敵眾己寡，久持不利，決意尋機速戰。部將黃蓋針對曹軍「連環船」的弱點，建議火攻，得到讚許。黃蓋立即遣人送偽降書給曹操，隨後帶船數十艘出發，前面10艘滿載浸油的乾柴草，以布遮掩，插上與曹操約定的旗號，並系輕快小艇於船後，順東南風駛向烏林。接近對岸時，戒備鬆懈的曹軍皆爭相觀看黃蓋來降。此時，黃蓋下令點燃柴草，各自換乘小艇退走。火船乘風闖入曹軍船陣，頓時一片火海，迅速延及岸邊營屯。聯軍乘勢攻擊，曹軍傷亡慘重。曹操深知已不能挽回敗局，下令燒余船，引軍退走。
聯軍水陸並進，追擊曹軍。曹操引軍離開江岸，取捷徑往江陵，經華容道(今潛江南)遇泥濘，墊草過騎，得以脫逃。曹操留曹仁守江陵，滿寵屯當陽，自還北方。
周瑜等與曹仁隔江對峙，並遣甘寧攻夷陵(今宜昌境)。曹仁分兵圍甘寧。周瑜率軍往救,大破曹軍，後還軍渡江屯北岸，繼續與曹仁對峙。劉備自江陵回師夏口後，溯漢水欲迂迴曹仁後方。曹仁自知再難相持，次年被迫撤退。
赤壁大戰後，劉備乘勝取得武陵、長沙、桂陽、零陵等四郡，次年又任荊州牧，奠定了壯大發展、進據益州的基礎。曹操吸取失敗教訓，大興水軍，進控江淮，與孫權對峙。孫權為抗曹，繼續與劉備聯盟，任其在荊州發展。
赤壁之戰之後，曹魏損失過大，一時無力南顧，給南方孫劉的發展創造了絕佳的機會。劉備鞏固了自己對於荊州的佔領，又利用這一段南北相對平靜的時期攻佔了長沙、零陵等四郡，自己的實力大為增強，這為以後攻佔西川奠定了基礎。北方對東吳的壓力一下減輕了下來，東吳的疆域也穩定下來，經過赤壁之戰，使曹、劉、孫的實力更加接進，所以說這使天下三分的局勢初步形成。