1940年9月27日由納粹德國、法西斯意大利與大日本帝國在德國柏林簽署了《德意日三國同盟條約》。此項協定正式確立了上述三個軸心國的同盟關係。
條約補充1936年的德日協定和反共產國際協定之不足，並消除德國與日本因1939年蘇德互不侵犯條約而起的嫌隙。後來，匈牙利(1940年11月20日)和羅馬尼亞(1940年11月23日)加入協定。
經過一番長時間的談判，該條約的簽字儀式在柏林舉行，德國外交部長約阿希姆·馮·裡賓特洛甫，意大利外長加萊亞佐·奇諾，日本特命全權大使來棲三郎最終簽訂了該條約。
隨後在1941年12月11日，德意日三國又補充簽訂了《德意日三國不單獨媾和協議》，作為回應，1942年1月，中美英蘇四大國發表了《聯合國宣言》。標誌著第二次世界大戰正式進入同盟國與軸心國兩大陣營對抗的時期。
德意日三國簽訂該協議後，日軍開始著手進行對蘇戰備，德國威脅美國必須保持中立。
協議簽訂後，日本大街小巷掛滿三國國旗慶祝。
9月28日的日本朝日新聞頭版頭條報道了三國同盟的簽訂。